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三、细胞实验D-荧光素钾盐体外生物发光试验：D-荧光素钾盐，无菌纯水，完全培养基（自行配制）1、贴壁细胞：将细胞接种于培养板中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁。悬浮细胞：可以将细胞接种于培养板后直接进行后续操作，无需孵育。如果倍增时间相对较短，则应考虑倍增时间进行细胞计数。2、将15mg荧光素钾盐溶解于1ml无菌水中，制备成100X荧光素储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素钾盐完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。3、用预热好的细胞培养基1∶100稀释100X荧光素储备液（15mg/ml），配制成荧光素工作液（终浓度150μg/ml），即配即用。4、去除培养板中的培养基。5、在成像前，将适量荧光素工作液加入细胞中，然后进行图像分析。注意：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。孵育时间取决于特定的细胞类型。一般来说孵育10分钟就足够了，根据需要进行测试和调整。6、每隔10分钟，**多40分钟，使用VILBERFUSIONFX成像系统检查体外生物发光，确定动力学曲线并找出细胞的峰值成像时间点Cy5.5含有一个游离胺基,可与多种官能团共轭,包括NHS酯和环氧化合物。四川厦门荧光染料

注：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定比较高信号检测时间和信号平台期。保存和操作的过程中都要避光。另外水溶性储存液过滤除菌后，可以-20℃或-80℃分装冻存，避免反复冻融。如果有条件，对储存液充氮气或氩气（防止氧化），稳定性和保存时间更长。 注射方式，动物类型以及体重等都会影响信号的发射，因此建议每次实验都要做荧光素酶动力学曲线，确定比较好信号平台期和比较好的检测时间。荧光素钾盐和荧光素钠盐应用上没有差别，两者的差别在于物理性状上如外形和溶解性。钠盐的水溶性高于钾盐。从目前发表的文献来看，钾盐的使用率远高于钠盐，尤其是体内实验。两者功效相同。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。四川厦门荧光染料生物发光是利用荧光素酶报告基因在体内表达产生的荧光蛋白与体外注射的荧光素底物发生化学反映产生荧光。

荧光染料标记蛋白或肽技术是一种常见的蛋白质体外标记技术。除了GFP等荧光蛋白的融合表达外，目标蛋白还可以通过荧光染料标记直接进行下游实验操作，如***跟踪、细胞分选等。

FITC荧光标记的原理是什么？

荧光标记所依赖的化合物称为荧光材料。荧光材料是指具有共轭双键系统化学结构的化合物。当受到紫外线或蓝紫光的照射时，它可以被刺激为刺激状态。当激发状态恢复到基本状态时，它会发出荧光。蛋白质荧光标记技术利用荧光材料的共价结合在目标分子的基团上，利用其荧光特性提供研究对象的信息。

5(6)-FITC(Fluorescein5(6)-isothiocyanate)是一种胺活性衍生物的荧光染料，具有广泛的应用，作为抗体和其他探针标记，用荧光显微镜，流式细胞仪、免疫荧光方法如ELISA和Western印迹实验。荧光素衍生物具有高吸收率、优异的荧光量子产率和良好的水溶性，是流式细胞仪和免疫荧光中生物检测**常用的荧光标记之一。**常用的荧光素包括用于标记蛋白质（特别是抗体）的异硫氰酸荧光素[5(6)-FITC)]，5-FITC和用于标记肽和寡核苷酸的羧基荧光素（5-FAM和5(6)-FAM）。BIOFOUNT提供***的基于荧光素的染料、底物和偶联物，以及一系列具有针对细胞标记和检测优化的特性的质量iFluor™荧光标记染料。南京星叶生物提供多种性价比高的各类活化荧光素，例如Cy系列、Super Fluor 系列（效果同Alexa Fluor系列）等。

使用萤火虫荧光素酶（Fluc）作为报告基因和 D-荧光素作为底物的生物发光成像（BLI）是目前应用*****的技术。将总信号强度相对于 D-荧光素注射后的时间进行绘制，以生成时间-强度曲线。除了峰值信号外，还确定注射 D-荧光素后固定时间点（5、10、15 和 20 分钟）的信号作为峰值信号的替代。给定时间-强度曲线中的信号针对曲线中的峰值信号进行归一化，以表示 D-荧光素注射后时间变化的模式[3]。每克体重注射 10 μL D-荧光素（腹膜内或静脉注射）储备液：对于 20 g 小鼠，标准 150 mg/kg 注射通常约为 200 μL。在室温下解冻 D-荧光素（钾盐或钠盐）并溶解在 dPBS（不含钙或镁）中，**终浓度为 15 mg/mL。通过吸取 5-10 mL 无菌水来预湿 0.22 μm 过滤器。SUPER Green I核酸染料特点 。广东脂质荧光染料

吲哚菁绿（Indocyanine Green，简称ICG）是一种广泛应用于医学和生物领域的荧光染料。四川厦门荧光染料

PI是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测，常用于流式细胞仪分析。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein,AM、Hoechst33258或Hoechst33342等一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。2.染色过程（1）将1/10培养基体积的PI染色液加入到细胞培养基中（也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基）。（2）在37℃培养细胞10～20分钟。（3）用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。（4）用535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。注意事项：PI对人体有刺激性，请注意适当防护。四川厦门荧光染料